|
|
|
| 当前位置：网站首页>>实验指导>>技术指导 | 请选择文字大小： | 默认 较大 更大 最大 |
| 实验三
植物病原菌的分离和培养 一、实验目的 在研究病原菌的形态、生理、生态以及病原菌对寄主植物的致病性等多种试验中，常常需要病原菌的纯培养物。然而，在自然情况下，病原菌通常是与其他杂菌混生在一起的，从受病组织或其他基物中将病原菌单独分选出来，叫作分离。分离和培养是植病实验室最基本的操作技术之一。通过本次实验学习植物病原菌分离培养的原理和常用的方法。 二、内容、材料和方法 (一)分离材料的选择 分离材料的选择对分离培养的成败有着决定的影响，因为在感病植物受害部位的内外，要有多种腐生菌，为减少腐生菌的污染，分离所用的病害材料应尽可能新鲜，并且最好在病、健交接处选材取样。病、健交接处，除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。 (二)分离方法 病原菌分离的方法因材料不同而异，植病实验室最常见的方法有组织分离法和稀释分离法两种。 1.组织分离法：这种方法适用于大部分病菌的分离，此法又分为小块组织分离和大块组织分离两种方法。分别以玉米大斑病、小麦根腐病和梨褐腐病为试材进行。 (1)叶斑病类病原菌的分离（玉米大斑病病菌的分离） 取玉米大斑病病叶，在病、健交界处剪取2—3毫米长的病组织。用10%漂白粉（次氯酸钙）溶液消毒（漂白粉溶液现用现配）3-5min，时间长短依病组织不同而异，然后直接移至PSA平板培养基上(为防止细菌污染，可在培养基中加入1000ppm链霉素10毫升)，倒置于20—25℃室温下，待菌落长出后挑取前缘菌丝，回接于PSA斜面培养基上，在25℃温箱中培养，待菌落颜色变深后，在无菌条件下镜检是否是玉米大斑病菌，弱仅有玉米大斑病菌的孢子，则说明已获得了纯培养，否则，则需要继续转至斜面培养基上进行纯化，直至获得纯培养。 (2)种子内部病原菌的分离（小麦根腐病菌的分离） 选择典型的小麦黑胚粒3—4个，在70%的酒精中浸2—3秒钟后，以镊子夹住投入0.1%升汞溶液中表面消毒2—3分钟（处理时间可自30秒至30分钟不等），然后取出小麦粒，以灭菌水冲洗3次，再移至已倒好的马铃薯琼脂平板培养基上，注意要以小麦的黑胚部位着靠在培养基上，倒置在25℃温箱中培养，待菌落长出后，挑取前缘菌丝于马铃薯斜面培养基上培养，培养3-4天后，无菌条件下镜检是否获得纯培养。 (3)病组织内部病原菌的分离（梨褐腐病菌的分离） 取梨褐腐病病果沾取95%酒精，用酒精火焰三次消毒后，以在灯焰灭过菌的解剖刀在果面病、健交界处切开，挑取豆粒大小的病组织放到马铃薯琼脂平板培养基上，每皿放3—4块，倒置于25℃温箱中培养2—3天。菌丝长出后转至马铃薯琼脂斜面培养基上，培养3-4天后，无菌条件下镜检是否获得纯培养。 2.稀释分离法：稀释分离法适用于细菌、土壤菌及产生孢子多的真菌等病原菌的分离，本次实验以白菜软腐病作为材料进行分类离。 白菜软腐病最易伴生腐生细菌，分离时需以病组织接种健康菜帮上，经数次转种予以纯化，其纯化方法是将菜帮经多次换水冲洗后，再用无菌水洗三次，切成适当大小，放在15厘米直径的培养皿中，菜帮下衬以吸水纸保温。用无菌解剖刀挑取病组织少许抹在菜帮的人为伤口上，培养在20—25℃下，经1天左右呈现腐烂，如此反复转种几次，至病斑纯净为止。 分离时，在新的水烂斑边缘挑取少量病组织在无菌水试管中配成菌悬液，取灭菌培养皿3付，标好次序，其内各置无菌水1毫升，用移置环移 取菌悬液一环，放在第1皿水中混合均匀，从中挑取一环稀释液至第2皿，再以同法稀释成第3皿，取熔化后冷至45℃左右的(一般将化好的培养基瓶靠近鼻尖，以不烫为度)牛肉膏蛋白胨培养基，每皿倒约15毫升，沿着桌面轻轻摇匀，凝固后倒置于26—28℃的温箱中培养，1—2日后可见白色，圆形或近圆形直径为1—2毫米的菌落，从中选典型菌落用移植环（划线法）移入牛肉膏蛋白胨斜面培养基上培养，每组转4—5管，注意过早出现的大型菌落多为腐生细菌。 以上分离实验也可以划线法进行，方法是先取两付灭菌培养皿，每皿倒入约15毫升熔化的牛肉膏蛋白胨培养基，沿桌面轻轻摇匀，制成平板，然后用移置环沾取一环稀释好的菌悬液，在第一个培养皿平面培养基的左方长方形区内划平行线5—7条，再以此移置环继续向右(和左方小区内的几条平行线成一定角度)划5—7条平行线，依此法划两皿，倒置于26—28℃温箱中培养，1—2日后挑单个典型菌落移到斜面培养基上，培养待用。 如果因季节关系难得白菜软腐病试材，则可用黄瓜细菌性角斑病、棉花角斑病、水稻白叶枯病病叶作试材进行分离培养实验。方法是取新鲜病叶，在病、健交接处取几小块病组织，以无菌水经多次换洗表面消毒后，放在比色板或凹玻片的凹窝内(凹窝要经两次酒精火焰消毒)，以吸管吸取无菌水滴入窝，并以灭菌的玻璃棒捣碎病组织，静置几分钟可得菌悬液，之后以上述划线法进行分离，注意葡萄糖对稻白叶枯病菌有抑制作用，故分离稻白叶枯病菌不能用葡萄糖配制牛肉膏蛋白胨培养基。 三、实验准备 (一)清洁环境：分离工作严格说应在无菌条下进行，无菌室或无菌箱是分离不可缺少的设施。若限于条件实验只能在普通房间进行时，必须对房间进行彻底扫除，清洁环境、搞好卫生。地上多洒些水，以消除室内尘埃，分离开始前准备好一切用品，避免工作过程中频繁走动，以破坏环境带来杂菌，工作台上铺好湿毛巾，点燃酒精灯。 (二)实验材料及用品准备 本次实验3-5人一组，请认真检查好下试材和用品是否齐备。 1病组织材料 小麦根腐病黑胚粒5粒。 玉米大斑病病叶1片。 白菜软腐病病帮 3块(相邻两组共用)； 梨褐腐病病果 1个(相邻两组共用)。 2用品准备 0.1%升汞溶液(广口瓶盛装)； 95%酒精(广口瓶盛装)； 1000ppm链霉素； 瓶装牛肉膏蛋白胨培养基； 瓶装马铃薯琼脂培养基； 此外，还有以下备品，无菌水1瓶，灭菌培养皿6付，灭菌1毫升吸管2支，解剖剪、解剖刀和镊子各1把，移植环，移植钩、酒精灯、珐琅盘和试管架各1个，毛巾1条，玻璃铅笔1支及火柴等。 四、作业：每人交分离到的纯菌种一支。 五、思考题 1分离植物病原菌常用的方法有几种? 这些方法适用于分离哪类病原菌? 怎样分离? 2分离植物病原物时，为什么要选择新鲜病材料，并且在病健交界处取样? 没有新鲜病材料怎么办? 3试分析分离工作成败的原因。 附：关于柯赫氏证病法则 (Koch′s postulate) 1882年，柯赫(Koch)在研究了人和动物的病害之后，提出了确定一种微生物致病性的三个必要条件：(一)这种微生物经常与某种病害有联系，发生这种病害往往就有这种微生物存在；(二)从病组织上可以分离得到这种微生物的纯培养，并且可以在各种培养基上研究它的性状；(三)将培养的菌种接种在健全的寄主上，可诱发出与原来相同的病害；史密斯(Smith)在1905年又补充以下一条，(四)从接种后发病的植物上，能再分离到原来的微生物。 |
|
|