第十章 凝集性试验

学习要点:

  凝集试验的概念、原理、分类,以及常用的凝集试验类型。  沉淀试验的概念、原理、分类,以及常用的沉淀试验类型

 

  由于所用抗原的性状不同,出现的现象也不同:

  1、细菌、红细胞或表面带有抗原的乳胶颗粒等不溶性颗粒抗原,当与相应抗体结合,抗原与抗体结合形成凝集团块,即称为凝集试验(agglutination)。

  2、病毒、蛋白质等可溶性抗原与抗体结合,在两者比例合适时,可形成较大的不溶性免疫复合物,在反应体系中出现不透明的沉淀物,称为沉淀反应(precipitation reaction)。

 

第一节 凝集试验(agglutination test)

  细菌、红细胞或表面带有抗原的乳胶颗粒等不溶性的颗粒抗原,当与相应抗体结合,在有电解质存在时,抗原与抗体结合形成凝集团块,即称为凝集试验。凝集试验中的抗原称为凝集原(agglutinogen),抗体称为凝集素(agglutinin)

一、凝集试验的一般原理

  通常,细菌和红细胞等颗粒性抗原在悬液中带弱负电荷,周围吸引一层与之牢固结合的正离子,外面又排列一层松散的负离子层,构成一个双离子层,使颗粒相互排斥。

  当特异抗体与相应抗原颗粒互补结合时,抗体的交联作用克服了抗原颗粒表面的电位,而使颗粒聚集在一起。

二、凝集试验的发生分两阶段

 1、抗原抗体的特异结合;

 2、在电解质的参与下,出现可见的凝集颗粒。

三、凝集试验的用途

  凝集试验方法简便,敏感度高,因而在临床检验中被广泛应用。

  1、可用于定性的检测, 即根据凝集现象的出现与否判定结果阳性或阴性。

  2、 也可进行定量检测, 即将标本作一系列倍比稀释后进行反应,以出现阳性反应的最高稀释度作为滴度。

四、凝集试验的分类

 1、直接凝集试验(direct agglutination)

  细菌、螺旋体和红细胞等颗粒抗原,在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集。

  直接凝集试验分为:玻板凝集试验和试管凝集试验。

 (1)玻板凝集试验:为定性试验方法

   ① 用已知抗体作为诊断血清、与待检颗粒抗原悬液各加一滴在玻板上,混匀;

   ② 数分钟后即可用肉眼观察凝集结果:出现颗粒凝集的为阳性反应

   此法简便、快速,适用于:细菌分离株的鉴定与分型;红细胞ABO血型的鉴定。

 (2)试管凝集试验:为定量试验方法

   ① 常用已知抗原液与一系列稀释的受检血清混合;

   ② 保温后观察每管内抗原凝集程度;以产生50%凝集的最高稀释度作为血清中抗体的效价,亦称为凝集价、滴度。

 (3)在试验中,由于电解质浓度和pH不适当等原因,可引起抗原的非特异性凝集,出现假阳性反应,因此必须设不加抗体的稀释液作对照组。

   自家凝集

   酸凝集


 2、间接凝集试验(indirect agglutination)

  将可溶性抗原(或抗体)先吸附于适当大小的颗粒性载体的表面,然后与相应抗体(或抗原)作用,在适宜电解质存在的条件下,出现的特异性凝集现象。

 (1)正向间接凝集试验:用抗原致敏载体以检测标本中的相应抗体。

 (2)反向间接凝集试验:用特异性抗体致敏载体以检测标本中的相应抗原。

 (3)间接凝集抑制反应:诊断试剂为抗原致敏的颗粒载体及相应的抗体,用于检测标本中是否存在与致敏抗原相同的抗原。
              也可用抗体致敏的载体及相应的抗原作为诊断试剂,以检测标本中的抗体,此称反向间接凝集抑制反应。

    间接凝集试验的作用:具有快速/敏感/操作简便/无需特殊的实验设备等特点,而且能用于抗原或抗体的测定;故在临床检验中广为应用。

 3、协同凝集试验(coaggoltination)

  与间接凝集试验的原理相似,只是所用载体既非天然的红细胞,也非人工合成的聚合物颗粒,而是一种金黄色葡萄球菌。 金黄色葡萄球菌的菌体细胞壁中含有A蛋白(SPA),SPA具有与IgG的Fc段结合的特性。因此当这种葡萄球菌与IgG抗体连接时,就成为抗体致敏的颗粒载体;如与相应抗原接触,即出现反向间接凝集试验。适用于细菌和病毒等的直接检测。

 4、抗球蛋白试验(antiglobulin test,coombs test)

  抗球蛋白试验的原理为间接凝集试验,主要用于检测单价的不完全抗体或封闭抗体。

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第二节 沉淀试验(Precipitation test)

  可溶性抗原与相应抗体发生特异性结合,两者比例合适时,可形成较大的不溶性免疫复合物,在电解质存在时,反应体系中出现不透明的沉淀物。

   沉淀反应分两个阶段:

    第一阶段:抗原抗体特异性结合;   第二阶段:形成可见的免疫复合物

    经典的沉淀反应在第二阶段观察或测量沉淀线或沉淀环等来判定结果,称为终点法;

    而快速免疫浊度法则在第一阶段测定免疫复合物形成的速率,称为速率法

一、环状沉淀试验(ring precipitation test)

  环状沉淀试验是Ascoli于1902年建立的;

  将免疫血清加到直径小于0.5cm的反应管底部;将含有可溶性抗原的材料重叠于上;

  抗原与抗体在两液界面相遇,形成白色免疫复合物沉淀环,故名为环状沉淀试验。

  此法简便易行;兽医上常用于炭疽杆菌抗原的检测。

二、絮状沉淀试验(flocculaton precipitation test)

  该法要点是:将抗原与抗体溶液混合在一起,在电解质存在时,Ag与Ab结合形成絮状沉淀物。

  这种沉淀试验受到Ag与Ab比例的直接影响,通常采用固定Ab稀释Ag的方法,Ag与Ab比例适合时,产生反应最快;Ag过剩或Ab过剩,则沉淀减少,甚至无沉淀。

  Ag过剩——前带;   Ab过剩——后带。

三、免疫比浊法(immunonephelomytry)

  当抗体浓度高,加入少量可溶性抗原,能形成一些肉眼看不见的小免疫复合物;可通过液体的光束发生散射;随着加入抗原增多,形成的免疫复合物也增多,光散射现象也相应加强。

  免疫比浊法就是在一定抗体浓度下,加入一定体积的样品,经过一段时间,用光散射浊度计测量反应液体的浊度,来推算样品中的抗原含量。


四、免疫扩散(immunodifusion)

  1%浓度的琼脂凝胶形成网络状结构,孔径约85nm,抗原和抗体在凝胶内可自由扩散;Ag-Ab复合物为超大分子,由于网孔的限度,而被网在琼脂中;即使浸泡也只能去除游离的Ag或Ab。

 1、单向扩散

  该方法由Oudin于1946年报道


2、双向单扩散

 (1)将抗体混入加热溶解的琼脂中,倾注于玻片上,制成含有抗体的琼脂板;

 (2)在适当位置打孔,将不同稀释度的抗原加入小孔,让抗原从小孔向四周的琼脂中扩散,与琼脂中的抗体相遇形成免疫复合物。

 (3) 当复合物体积增大到一定程度时停止扩散,出现以孔为中心的圆形沉淀圈。

3、双向双扩散试验:也称为琼脂扩散试验,琼扩


  (1)在1%琼脂板上按一定距离打孔;         (2)在相邻的两孔内分别放入抗原和抗体材料。

  (3)当抗原和抗体向四周凝胶中扩散,在两孔间可出现1~2条沉淀线。

  本法常用于:抗原或抗体的定性或定量检测或用于两种抗原材料的抗原相关性分析。

五、免疫电泳技术

  免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物;其优点就是加快了沉淀反应的速度。

  这里仅介绍常用的免疫电泳技术。

 1、免疫电泳(immunoelectrophoresis)

   是将电泳技术与琼脂扩散相结合的技术,分成两个步骤,即:先进行电泳,再进行琼脂扩散。

  (1)将抗原样品加入琼脂中电泳,将各成分依电泳速度不同而分开;

  (2)在适当位置沿电泳方向挖一直槽,于槽内加入含有针对各种抗原混合抗体液;

  (3)让各抗原成分与相应抗体进行琼脂扩散;

  (4)一定时间后可形成多条沉淀线。

  常用此法进行血清的蛋白种类分析;对于免疫球蛋白缺损或增多的疾病的诊断或鉴别诊断有重要意义。

 2、对流电泳(counterimmunoelectrophoresis)

 (1) 对流电泳的原理

  ① 蛋白质是两性分子:pH<pI时,Pr.带正电;pH>pI时,Pr.带负电。

  ② 一般情况下,抗体和抗原多为蛋白质;当在pH8.2以上的溶液中,抗体和抗原都带负电;但抗体的pI比较高,所以抗体带的电荷比较少。

  ③ 琼脂本身带SO42-,可通过静电感应使溶液分子带正电;故在电场的作用下,可以形成一种向负极的推力,我们称之为“电渗”

     抗原带的电荷多,所受的电场力可以克服电渗——向正极移动
     抗体带的电荷少, 所受的电场力不能克服电渗——向负极移动

  ④ 对流电泳是在电场作用下的双向免疫扩散,该法敏感快速。

 (2)对流电泳的操作方法

  ① 在琼脂板上打两排孔,一侧各孔加入待测抗原,另一侧孔内放入相应抗体,抗原在负极侧,抗体在正极侧。

  ② 将琼脂板放入电泳槽内并通电,带负电荷的抗原向正极侧泳动,而抗体借电渗作用向负极侧泳动。

  ③ 大约1~2小时可在中间或抗体的另一侧形成沉淀线。

  ④ 条带形成的形状与抗原抗体泳动的速率有关。


3、免疫火箭电泳(rocketimmunoelectrophoresis)

  是由单向扩散发展起来的一项定量技术,实质上是加速的单向扩散。

 (1)在含抗体的琼脂板一端打一排抗原孔;

 (2)加入待测抗原后,将抗原置负极端,用2~3mA/cm的电流强度进行电泳;

 (3)抗原泳向正极,当抗原抗体比例合适时,形成肉眼可见的沉淀峰;
    由于电泳继续进行,样品孔不断有Ag移向Ag-Ab复合物,当Ag过剩时沉淀溶解而在前面又形成新的Ag-Ab复合物的沉淀峰。

 (4)如此反复向前,形成火箭状的沉淀峰;
    其沉淀峰高度和Ag的浓度成正比,与同样条件下已知浓度的Ag-Ab比较,即可求得待测的Ag含量。

 4、免疫印迹法(immunoblotting,又称为Western-blot)

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复习思考题:

 1、什么是凝集试验?什么凝集原?什么是凝集素?

 2、什么是凝集价?

 3、凝集试验的分类,以及常用的凝集试验有哪些?

 4、什么是协同凝集试验、抗球蛋白试验?

 5、什么是沉淀试验?什么沉淀原?什么是沉淀素?

 6、琼脂扩散的原理。

 7、什么是电渗及其在电泳的作用?

 8、免疫电泳和对流电泳的原理?

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